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透射电镜常温超薄切片制备方法
发布时间: 2024-12-16    被阅览数:

取材及固定:

  1. 组织样本:

    • 样品尺寸要求:1~2 mm³ 左右。

    • 加入 2.5% 戊二醛,于 4°C 保存。

    • 对于特定形态的组织样品(如肠道等),取材时至少保证组织块一个面的厚度为 1 mm。

    • 对有切片方向要求的组织样品,需标识切片横纵轴方向。

  2. 细胞/细菌样本:

    • 细胞团要求至少半个绿豆大小。

    • 悬浮培养细胞/细菌,离心收集,弃去培养液,加入 2.5% 戊二醛,用牙签拨散细胞团,于 4°C 保存。

    • 对于贴壁细胞,先倒去培养液,加入 2.5% 戊二醛,4°C 固定 15 分钟,用细胞刮刮下,离心收集(固定液保留),于 4°C 保存。

    • 固定时间:至少 4 个小时。

饿酸固定:

  • 将用戊二醛固定的细胞或组织,经 0.1 M 磷酸缓冲液(pH 7.2)漂洗 3 次,每次 15 分钟。

  • 再用 1% 饿酸•0.1 M 磷酸缓冲液(pH 7.2)室温(20°C)固定 2 小时(固定时间因样品不同而适当调整)。

  • 然后再经 0.1 M 磷酸缓冲液(pH 7.2)漂洗 3 次,每次 15 分钟。

脱水:

  • 样品脱水经 30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100%(两次)酒精梯度脱水,每次 15~20 分钟(含水量多、细胞膜厚的样品可适当延长脱水时间)。

渗透:

  • 渗透剂依次为丙酮:环氧树脂(2:1)、丙酮:环氧树脂(1:1)、环氧树脂,37°C 温箱内,每次渗透 8~12 小时。

包埋:

  • 将渗透好的样品放入胶囊或包埋板中,加入包埋剂环氧树脂,在 60°C 温箱中聚合 48 小时。

超薄切片:

  • 切片厚度:80~100 nm。

双染色:

  • 铀铅双染色(2% 醋酸铀饱和水溶液,枸橼酸铅,室温染色 15 分钟),切片室温干燥过夜,电镜观察。

电镜型号:

  • TEM Hitachi HT7700

  • 产地:Japan


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