取材及固定:
组织样本:
样品尺寸要求:1~2 mm³ 左右。
加入 2.5% 戊二醛,于 4°C 保存。
对于特定形态的组织样品(如肠道等),取材时至少保证组织块一个面的厚度为 1 mm。
对有切片方向要求的组织样品,需标识切片横纵轴方向。
细胞/细菌样本:
细胞团要求至少半个绿豆大小。
悬浮培养细胞/细菌,离心收集,弃去培养液,加入 2.5% 戊二醛,用牙签拨散细胞团,于 4°C 保存。
对于贴壁细胞,先倒去培养液,加入 2.5% 戊二醛,4°C 固定 15 分钟,用细胞刮刮下,离心收集(固定液保留),于 4°C 保存。
固定时间:至少 4 个小时。
饿酸固定:
将用戊二醛固定的细胞或组织,经 0.1 M 磷酸缓冲液(pH 7.2)漂洗 3 次,每次 15 分钟。
再用 1% 饿酸•0.1 M 磷酸缓冲液(pH 7.2)室温(20°C)固定 2 小时(固定时间因样品不同而适当调整)。
然后再经 0.1 M 磷酸缓冲液(pH 7.2)漂洗 3 次,每次 15 分钟。
脱水:
样品脱水经 30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100%(两次)酒精梯度脱水,每次 15~20 分钟(含水量多、细胞膜厚的样品可适当延长脱水时间)。
渗透:
渗透剂依次为丙酮:环氧树脂(2:1)、丙酮:环氧树脂(1:1)、环氧树脂,37°C 温箱内,每次渗透 8~12 小时。
包埋:
将渗透好的样品放入胶囊或包埋板中,加入包埋剂环氧树脂,在 60°C 温箱中聚合 48 小时。
超薄切片:
切片厚度:80~100 nm。
双染色:
铀铅双染色(2% 醋酸铀饱和水溶液,枸橼酸铅,室温染色 15 分钟),切片室温干燥过夜,电镜观察。
电镜型号:
TEM Hitachi HT7700
产地:Japan