主要用途

组织基质金属蛋白酶13（MMP13）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针MCA供体和DAP/DNP受体双重标记的多肽底物PChaGNvaHA，受到MMP13蛋白酶的水解，解离抑制基团，产生荧光产物，即采用荧光法来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中基质金属蛋白酶13的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。

技术背景

基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。基质金属蛋白酶13（MMP13），又称为胶原酶3（collagenase 3），其目标蛋白是胶原蛋白（collagen）、明胶蛋白（gelatin）、纤维蛋白溶酶原（plasminogen）、聚糖（aggracan）和基质细胞衍生因子（CXCL12）等。MMP13与肿瘤和关节炎等发生有关。MMP13酶原型为60kD，而活化型为48kD和更小分子。基于多肽底物PChaGNvaHA两端标记的供体荧光探针7-甲氧基香豆素（7-methoxycourmarin）受到另一个受体基团二硝基苯二氨基异丁酰[N-3-（2,4-dinitrophenyl）-L-α-β-diaminopropionyl；Dap]的抑制而荧光淬灭（quench）。一旦多肽的Gly-Nva键受到MMP13水解，释放出具有强烈荧光的7-甲氧基香豆素多肽片段，据此根据其荧光强度（激发波长330nm，散发波长400nm）的变化，来定量测定基质金属蛋白酶13的特异活性。其反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）         毫升

裂解液（Reagent B）         毫升

缓冲液（Reagent C）         毫升

底物液（Reagent D）         微升

标准液（Reagent E）              微升

产品说明书             1份

保存方式

保存底物液（Reagent D）和标准液（Reagent E）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保证3月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准样品配制和样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应孵育

黑色96孔板：用于荧光分析的容器

荧光酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、样品准备

1． 手术取出动物组织，并秤重500毫克

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （选择步骤）抽去清理液

5． 移入到一个液氮冻存管

6． 即刻放进液氮罐过夜

7． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

8． 放进一个15毫升锥形离心管

9． 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B） 

10． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11． 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12． 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g

13． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

15． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如组织裂解萃取液或纯化酶样品等），置于冰槽里

2． 设定好荧光酶标仪（温度为37℃）：激发波长330nm，散发波长400nm，间隔5分钟，读数6次（共30分钟）

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 标准样品配制

1． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

2． 分别加入xx微升缓冲液（Reagent C）到1至5号管

3． 移取xx微升标准液（Reagent E）到1号管，混匀

4． 小心移取xx微升1号管稀释的标准液（Reagent E）到2号管，混匀

5． 小心移取xx微升2号管稀释的标准液（Reagent E）到3号管，混匀

6． 小心移取xx微升3号管稀释的标准液（Reagent E）到4号管，混匀

7． 将1至5号管放进冰槽里备用；标准管浓度见下表

四、荧光测定

1． 在黑色96孔板上做好相应标记：标准样品、样品活性

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到相应孔里

3． 分别加入20微升上述配制的标准液或待测样品（20微克纯化酶或100微克组织裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）

4． 放进37℃培养箱里孵育10分钟

5． 分别加入xx微升底物液（Reagent D）

6． 轻轻摇动黑色96孔板

7． 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数RFU（Relative Fluorescence Unit）

8． 标准样品实际荧光读数：标准样品值—背景对照值

9． 待测样品实际荧光读数：5分钟荧光读数—背景对照荧光读数

10． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位RFU；横座标（X轴）为标准甲氧基香豆素多肽浓度（微摩尔/升）

11． 根据标准曲线获得样品活性对应甲氧基香豆素多肽浓度（微摩尔/升）

五、计算样品活性

注意事项

1． 本产品为25次操作，包括标准液

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准液测定只需1次

4． 样品须澄清，至关重要

5． 样品准备要点如下：

a) 样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂

b) 样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR）

c) 如果样品中的基质金属蛋白酶活性很低，可以使用活化剂（建议使用胶原酶潜酶活化剂（APMA）－12197）

6． 如果用户没有特定的滤波器，可以使用激发波长320至340nm之间的任一波长，散发波长390至420nm之间的任一波长

7． 测定值由低到高变化；通常测定持续5分钟，如果酶活性过低，可以持续测读30分钟

8． 荧光读数增加，表明具有酶活性

9． 待测样本为酶粗提样品，其蛋白浓度为20微克/20微升；待测样本为总蛋白，其蛋白浓度为100微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）

10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

11． 可以使用基质金属蛋白酶13抑制剂CL-82198作为抑制剂对照或阴性对照

12． 基质金属蛋白酶13活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）水解1纳摩尔的多肽底物PChaGNvaHA

13． 本公司提供系列基质金属蛋白酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感