组织糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测
试剂盒产品说明书
主要用途
组织糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测试剂是一种旨在通过高盐萃取可溶性糖胺多糖,与二甲基亚甲基蓝染料结合,在丙醇解离溶液中,释放紫红色染料,由分光光度仪比色分析,定量检测组织样品中糖胺多糖含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种人体或动物组织(皮肤、肌肉等)、软骨、结缔组织、肿瘤组织等糖胺多糖水平检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,检测准确。
技术背景
糖胺多糖(glycosaminoglycan;GAG),又称为粘多糖(mucopolysaccharide),是体内最为丰富的异源多聚糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖,由重复的二糖单位,包括六碳糖(hexose)或己糖醛酸(hexuronic acid),链接到己糖胺(hexoamine)上而成。糖胺多糖与核心蛋白(core protein)共价相联,构成蛋白多糖(proteoglycan;PG),成为细胞膜和细胞外基质(extracellular matrix;ECM)的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成过程中发生硫酸酯化(sulfated group),其部位在O或N位上,有利于发挥各种不同的作用,包括酶的调节、细胞黏附、生长、迁移、分化,以及组织损伤反应。基于糖胺多糖的高度负电荷的特点,使用异染性(metachromatic)阳离子蓝色染料二甲基亚甲基蓝(1,9-dimethylmethylene blue;DMMB),在酸性条件下,特异性的结合产生不溶性紫色或粉红色糖胺多糖染料复合物(Dye-GAG complex),在丙醇解离溶液中,释放出染料,通过分光光度仪(656nm波长)测定,来定量分析糖胺多糖的总含量。
产品内容
清理液(Reagent A) 60毫升
萃取液(Reagent B) 20毫升
染色液(Reagent C) 25毫升
解离液(Reagent D) 25毫升
标准液(Reagent E) 100微升
产品说明书 1份
保存方式
保存萃取液(Reagent B)在-20℃冰箱里;其余的保存在4℃冰箱里;染色液(Reagent C)避免光照;有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器
恒温水槽或干式恒温仪:用于样品反应
微型台式离心机:用于样品操作
比色皿或96孔板:用于比色分析的容器
分光光度仪或酶标仪:用于比色分析
实验步骤
一、样品预处理
1. 手术取出动物组织,并秤重以确定200毫克组织重量
2. (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
3. (选择步骤)加入3毫升清理液(Reagent A)清洗1次
4. 移入到一个液氮冻存管
5. 即刻放进液氮罐过夜
6. 次日从液氮罐里取出,即刻(最快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融)
7. 放进一个1.5毫升离心管
8. 加入500微升萃取液(Reagent B)
9. 强力涡旋震荡1分钟,充分混匀
10. 放进56℃恒温水槽孵育16小时
11. 放进90℃恒温水槽孵育10分钟
12. 放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
13. 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
14. 置于冰槽里备用
二、标准样品配制
1. 准备好5个1.5毫升离心管,标记为1至5号管
2. 分别加入50微升清理液(Reagent A)到1至5号管
3. 移取50微升标准液(Reagent E)到1号管,混匀
4. 小心移取50微升1号管稀释的标准液(Reagent E)到2号管,混匀
5. 小心移取50微升2号管稀释的标准液(Reagent E)到3号管,混匀
6. 小心移取50微升3号管稀释的标准液(Reagent E)到4号管,混匀
7. 将1至5号管放进冰槽里备用;标准管浓度见下表
管号 | 清理液(Reagent A) | 标准液(Reagent E) | 标准糖胺多糖含量 |
1 | 50微升 | 50微升 | 5微克 |
2 | 50微升 | 50微升1号管 | 2.5微克 |
3 | 50微升 | 50微升2号管 | 1.25微克 |
4 | 50微升 | 50微升3号管 | 0.625微克 |
5 | 50微升 | 0 | 0 |
三、 标准曲线测定
1. 移取50微升上述配制的标准液(Reagent E)到1.5毫升离心管
2. 加入1毫升染色液(Reagent C)
3. 涡旋震荡15秒
4. 室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒(注意:可见紫色或粉红色沉淀)
5. 即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g
6. 小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)
7. 加入1毫升解离液(Reagent D)
8. 涡旋震荡15秒
9. 室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解)
10. 转移到新的比色皿
11. 即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得标准样品吸光读数
12. 重复实验步骤1至11四次
13. 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光读数;横座标(X轴)为标准糖胺多糖含量(微克)
四、 样品测定
1. 加入50微升上述制备的待测样品到1.5毫升离心管
2. 加入1毫升染色液(Reagent C)
3. 涡旋震荡15秒
4. 室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒(注意:可见紫色或粉红色沉淀)
5. 即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g
6. 小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)
7. 加入1毫升解离液(Reagent D)
8. 涡旋震荡15秒
9. 室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解)
10. 转移到新的比色皿
11. 即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得样品吸光读数
12. 根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量(微克)
五、 浓度计算
根据上述标准曲线样品对应糖胺多糖含量(微克)÷0.050(样品容量;毫升)=微克糖胺多糖/毫升
注意事项
1. 本产品为25次操作,包括标准样品
2. 本产品不适合于非硫酸酯化的二糖降解片段、透明质酸(hyaluronate)的检测
3. 本产品可以检测硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、硫酸角质素(keratan sulfate)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、硫酸类肝素(heparan sulfate)等主要糖胺多糖
4. 本产品检测范围为0.2至5微克糖胺多糖
5. 操作时,须戴手套
6. 系统操作时,标准样品测定只需1次
7. 空白对照读数通常小于0.06,如果超过表明抽去上清操作不当
8. 孵育时,避免光照
9. 如果样品糖胺多糖含量过低,可以浓缩样品或增加样品量至100微升
10. 样品浓度可以表述为:微克糖胺多糖/组织重量;微克糖胺多糖/组织总蛋白等
11. 本公司提供系列糖类代谢检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感
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